亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂的研制
来源:    发布时间: 2018-09-26 15:15   1787 次浏览   大小:  16px  14px  12px
  总胆红素是人体内结合(直接)胆红素与非结合(间接)胆红素的总和.总胆红素增加,通常是由于胆道阻塞、肝炎、肝硬化、溶血性综合征和某些遗传性酶缺乏所致.近年来一些研究表明,血液中胆红素低于正常值常与冠心病有关.因此,对人体的血清、血浆或尿液
  总胆红素是人体内结合(直接)胆红素与非结合(间接)胆红素的总和.总胆红素增加,通常是由于胆道阻塞、肝炎、肝硬化、溶血性综合征和某些遗传性酶缺乏所致.近年来一些研究表明,血液中胆红素低于正常值常与冠心病有关.因此,对人体的血清、血浆或尿液中总胆红素的测定,是医学检验最常规的项目之一.目前,血清总胆红素的测定方法主要有重氮法、胆红素氧化酶法和钒酸氧化法.但重氮法试剂不稳定[1],胆红素氧化酶法特异性好,几乎不受溶血,脂浊等的干扰,但因酶的来源、纯度、稳定性及价格等原因难于推广.钒酸氧化法的钒酸盐对仪器和环境存在潜在的污染,甚至影响豆类作物的生长[2],经过使用各种化学氧化剂氧化胆红素的实验研究,作者成功研制了一种亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂,该试剂线性范围宽、抗干扰性强、反应曲线规范、能迅速达到终点且测定的准确度和精密度高,无环境污染问题.
  1 材料与方法
  1.1 材料
  1.1.1 总胆红素试剂试剂R1:柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液,pH 2.9,加有聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、EDTA-Na2.试剂R2:含亚硝酸钠、氢氧化钠及碳酸钠.
  1.1.2 对照试剂市售化学氧化法试剂盒.
  1.1.3 质控品英国朗道RANDOX公司生产,正常值27.2μmol/L(批号561UN),异常值80.4μmol/L(批号384UE).
  1.1.4仪器HITICH7060全自动生化分析仪.
  1.2 测定方法
  测定总胆红素的生化分析仪参数:终点法,检测波长为450 nm(主)/546 nm(次),反应温度37℃,标本10μL,试剂R1为240μL,试剂R2为60μL,第一试剂反应时间300 s,第二反应时间300 s.
  2 结果
  2.1 试剂R1缓冲体系及浓度选择
  分别配制100 mmol/L的柠檬酸和酒石酸缓冲液,pH均为2.9,其他实验条件不变,测定浓度为27.2、80.4μmol/L的质控血清,反应曲线柠檬酸缓冲液加入试剂R2前很平,加入后很快反应到终点.酒石酸缓冲液反应较慢,不适宜高值胆红素测定,故选用柠檬酸缓冲液.然后将pH 2.9的柠檬酸缓冲液配成50、100、150、200 mmol/L系列浓度,其他条件不变,测定高、低浓度质控血清.结果显示在100 mmol/L时,灵敏度最适合,稳定性最好,结果最接近靶值,故选用100 mml/L的浓度.
  2.2 柠檬酸缓冲液pH值的选择
  将柠檬酸缓冲液配成pH 1.0、1.5、1.9、2.4、2.9、3.4、3.9,其他条件不变,测定同一份质控血清.结果显示pH低于1.9时,反应出现浑浊,影响结果测定.pH升高时反应速度变慢,不利于高胆红素标本在规定时间内达到反应终点.当pH 2.9时测定结果最好,故pH值确定为2.9.
  2.3 试剂R2亚硝酸钠最佳用量选择
  配制亚硝酸钠浓度分别为1、2、4、6 mmol/L,其他条件不变,测定质控血清.结果显示亚硝酸钠浓度过低,会导致高浓度标本胆红素氧化不彻底,反应速度缓慢;亚硝酸钠浓度过高,则会出现低值标本“吸光度-时间”反应曲线翘尾现象,影响结果的准确性.选择亚硝酸浓度为4 mmol/L时测定结果为最佳.
  2.4 试剂R1中表面活性剂的选择
  分别用溴化十六烷基三甲基铵和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)作为总胆红素试剂的表面活性剂,发现试剂中分别加入0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 g/L溴化十六烷基三甲基铵所测得结果均与对照试剂所测结果存在显著差别,而当试剂中分别加入0.25、2.5、5.0、10.0、20.0 ml/L的聚乙二醇辛基苯基醚测定标本时发现:含有10.0 ml/L以下聚乙二醇辛基苯基醚的试剂测得的总胆红素结果值最接近对照试剂所测结果.但高于10.0 ml/L聚乙二醇辛基苯基醚会导致脂浊标本结果明显偏高,而低浓度时能加速总胆红素的氧化速度,使得高总胆红素标本测定结果不偏低,从而保证有较宽的线性检测范围.故选用0.25 ml/L的聚乙二醇辛基苯基醚以满足各种标本检测. http://www.pbchem.net/